Il DNA e il codice genetico

L’acido desossiribonucleico si trova nel nucleo di ogni cellula e contiene tutte le informazioni genetiche di un organismo. In pratica costituisce il nostro patrimonio genetico ereditario. Il DNA è formato da tre parti: acido fosforico, desossiribosio (zucchero) e una base azotata (A: adenina G: guanina C: citosina T: timina. La molecola di DNA è formata da due filamenti avvolti a spirale al cui interno si trovano le basi azotate accoppiate tra loro. 

Le basi azotate presenti differenziano i nucleotidi che costituiscono il DNA.
Il DNA è un polimero organico costituito da nucleotidi, su ogni nucleotide è presente una base azotata variabile tra quelle in figura. Le basi azotate si dividono in purine e pirimidine, le prime sono molecole con due anelli, mentre le seconde sono costituite da un anello singolo. Nell’RNA l’uracile sostituisce la timina.

L’ordine in cui si trovano i nucleotidi nel DNA costituisce il codice genetico che opportunamente tradotto attraverso l’RNA permette la sintesi delle proteine. Tuttavia per comprendere l’ordine in cui si trovano i vari nucleotidi è necessario approfondire le strutture del DNA. Come già detto ogni monomero è costituito da una base azotata, un gruppo fosfato ed una molecola di 2-deossi-D-ribosio (il ribosio è privo dell’atomo di ossigeno in posizione 2). Il gruppo fosfato è posizionato sul carbonio 5 dello zucchero, ma, per non fare confusione con i carboni delle basi azotate si dice che il gruppo fosfato è in posizione 5’. Le basi azotate sono legate allo zucchero sul carbonio 1’ attraverso un legame N-glicosidico in posizione β ovvero il legame avviene tra un atomo di azoto della base azotata e la posizione equatoriale del carbonio 1’.  L’atomo di azoto partecipante al legame N-glicosidico varia a seconda della base azotata: nel caso della citosina e della timina (basi pirimidiniche) l’atomo di azoto chiamato in causa è quello in posizione 1, mentre nel caso della guanina e dell’adenina (basi puriniche) l’atomo di azoto impegnato nel legame N-glicosidico è quello in posizione 9.

 

All'interno de il DNA sono presenti tanti legami N-glicosidici quanto è il numero dei nucleotidi che contribuiscono alla struttra del DNA.
Come già detto il DNA è costituito da nucleotidi formati da deossiribosio, un gruppo fosfato ed una base azotata. In figura sono invece presenti i cosìddetti nucleosidi, vale a dire dei nucleotidi privi del gruppo fosfato. Il legame N-glicosidico si viene a formare tra il carbonio 1′ dello zucchero ed un atomo di azoto che varia a seconda della della base azotata..

La struttura primaria del DNA è determinata quindi dalla sequenza di nucleotidi che sono legati tra loro attraverso i gruppi fosfato. Ogni gruppo fosfato è quindi legato a due molecole di desossiribosio, ad una è legato in posizione 5’, mentre all’altra è legato in posizione 3’. Tuttavia, sin dal 1938 è noto grazie alla diffrazione ai raggi X che il DNA ha una struttura molecolare ben precisa. Nel 1950 E. Chargaff analizzando il DNA di animali diversi, scoprì che in ogni caso il rapporto tra la quantità di adenina e timina ed il rapporto tra citosina e guanina era uguale a 1, ma soltanto nel 1953 Watson e Crick (che successivamente vinsero il Nobel per la medicina) riuscirono a formulare una teoria plausibile per la struttura del DNA, vale a dire la struttura a doppia elica.

Il DNA rappresentato in tre diversi modi, evidenziando i nucleotidi primi, e mostrandolo tridimensionalmente poi.
Tre diverse rappresentazioni della struttra del DNA. Nel primo caso si mettono in evidenza le singole componenti di nucleotidi, nel secondo caso viene mostrato come appara la doppia elica che costituisce il DNA mentre il terzo caso rappresenta il DNA in maniera tridimensionale.

Secondo tale struttura il DNA è costituito da due catene polinucleotidiche antiparallele avvolte intorno ad un asse comune, che formano quindi le due eliche destrorse. Le due eliche sono tenute insieme dai legami a idrogeno che si vengono a formare tra le basi azotate giacenti perpendicolari al piano dell’elica, vale a dire adenina con timina e citosina con guanina. Il modello a doppia elica prevede un diametro pari a 20 Å, che le coppie di basi azotate adiacenti siano distanti 3,4 Å e che le coppie si ripetano ogni 36°. Questo implica che per ogni giro completo dell’elica ci siano 10 coppie di basi azotate. Recentemente è emerso che la struttura proposta da Watson e Crick è soltanto una tra le possibili strutture del DNA. Attualmente le strutture di DNA vengono classificate in tre diverse categorie: A,B e Z. La struttura scoperta da Watson e Crick non è altro che la tipologia B, ovvero la più comune.

Il DNA può essere trovato in tre diverse forme, e ciascuna di esse è dotata di una struttura diversa.
Le tre possibili strutture del DNA, rispettivamente la forma A, la forma B e la forma Z. La forma più comune in cui si trova il DNA è proprio la forma B scoperta da Watson e Crick.

Nella forma A le basi azotate sono inclinate fino a 20° rispetto all’asse, mentre nella forma Z alcune basi sono ruotate di 180° rispetto al legame N-glicosidico, il che porta alla formazione di un’elica sinistrorsa. Con il modello a doppia elica proposto da Watson e Creek, è stato possibile dedurre come avviene la replicazione del DNA. In questo caso i due scienziati hanno ipotizzato che i filamenti si dividessero, con  la rottura dei legami a idrogeno tra le basi azotate. A questo punto i due filamenti srotolati, possono legare nuovi nucleotidi, sfruttando la complementarietà delle basi azotate. I nucleotidi presenti nel nucleo, sono tuttavia sotto forma di trifosfati (legano tre gruppi fosfato consecutivi anziché uno solo), per cui, un enzima si occupa di legare il nucleotide alla catena primaria (DNA polimerasi) ed un altro enzima si occupa di unire la nuova catena così formata (DNA ligasi).

La DNA polimerasi si occupa di sintetizzare una nuova doppia elica di DNA.
I nuovi filamenti di DNA che avranno struttura analoga, vengono sintetizzati grazie ad enzimi come la DNA polimerasi e la DNA ligasi. In questo caso è possibile notare come opera la DNA polimerasi nella sintesi di nuovi filamenti.

Lo stesso principio viene sfruttato per la sintesi delle proteine dall’RNA messaggero, ovvero un filamento di mRNA si lega al filamento di DNA appena separato, con la differenza con la differenza che nell’RNA è presente l’uracile al posto della timina. Una serie di tre basi azotate sull’RNA codifica un amminoacido, e la sequenza di amminoacidi costituisce poi la proteina. Si dice che il codice genetico è degenere, poiché sono disponibili 20 amminoacidi distinti, per 64 possibili combinazioni di basi azotate. Per meglio comprendere le informazioni genetiche contenute nel DNA è necessario effettuare il sequenziamento delle basi azotate contenute nelle varie molecole DNA. L’operazione è tutt’altro che semplice, dato che anche le più piccole molecole di DNA contengono almeno 5000 nucleotidi, mentre le più grandi possono arrivare fino ad un milione.

Il processo di sequenziamento richiede diverse reazioni enzimatiche per arrivare a compimento, tuttavia si inizia sempre adoperando endonucleasi di restrizione, vale a dire degli enzimi che “tagliano” la molecola di DNA in presenza di sequenze note di quattro basi. In questo modo si ottengono filamenti di lunghezza compresa tra 150 e 100 nucleotidi. A questo punto i filamenti vengono ulteriormente degradati, attraverso altri enzimi che tagliano la molecola in presenza di una base precisa e ripetendo l’operazione per ciascuna delle quattro basi su di uno stesso filamento, si ottengono filamenti di alcune unità nucleotidiche. I nuovi filamenti vengono quindi sottoposti ad elettroforesi su gel. Tramite l’elettroforesi è possibile comprendere in che sequenza si trovavano i nucleotidi quando erano formavano il DNA. Nell’ultimo mezzo secolo sono stati fatti passi da gigante nel campo del sequenziamento del DNA, infatti nel 1978 era possibile sequenziare solo fino a 200 nucleotidi, mentre nel 1985 era già possibile sequenziare oltre 170000 unità nucleotidiche. Al giorno d’oggi è possibile sequenziare diverse migliaia di unità nucleotidiche al giorno.

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DNA – Generalità e struttura

Codice genetico e traduzione

Watson e Crick avevano chiarito, grazie al loro modello, la struttura del DNA; inoltre indicarono il meccanismo alla base della sua duplicazione. Era stato accertato che il DNA contenesse le istruzioni necessarie alla sintesi delle molecole biochimiche e che queste istruzioni potessero essere trasmesse alla progenie. Rimanevano però ancora aperte due domande:
  1. Come sono codificate le istruzioni nel DNA?
  2. Come vengono trasportate queste istruzioni all’esterno del nucleo delle cellule eucarioti?

I primi passi del lungo cammino che porterà i biologi alla comprensione dei meccanismi con cui il DNA controlla le cellule furono mossi da un medico inglese, Archibald Garrod, nel 1908. Egli, studiando le possibili cause alla base di una malattia detta alcaptonuria, ipotizzò che ci potessero essere degli errori congeniti del metabolismo, quindi qualcosa che fosse ereditario. Avanzò l’ipotesi che questa malattia fosse causata da carenze enzimatiche; come dire che i geni influissero sulla produzione di queste particolari proteine.

Nel 1939 Torbjörn Caspersson e Jean Brachet scoprirono che le cellule che producono molte proteine sono ricche di RNA, intuendo quindi che questa molecola è necessaria per produrre delle catene polipeptidiche. Nel 1941 George Beadle, un genetista, capì che i geni controllano la sintesi degli enzimi. Con Edward Tatum, un altro genetista, utilizzò la comune muffa del pane, Neurospora crassa, per allestire una serie di esperimenti; impiegando i raggi X per indurre le mutazioni, essi capirono che, ad una certa mutazione, corrispondeva la perdita di funzionalità di un certo enzima. Venne coniata il famoso dogma centrale della biologia: “un gene, un enzima”, successivamente modificato nel più corretto: “un gene, una funzione”. Nel 1949 il chimico Linus Pauling, studiando l’emoglobina di persone affette da anemia falciforme, di persone sane e di persone portatrici del gene, capì che una persona affetta da anemia falciforme possiede una emoglobina diversa da quella delle persone sane. Nel 1959 Severo Ochoa scoprì il meccanismo di sintesi dell’RNA; inoltre mise a punto un metodo per sintetizzare dei filamenti di RNA artificiali. Nel 1961 Niremberg e Matthaei idearono la maniera di decifrare il codice genetico. Essi utilizzarono degli estratti cellulari contenenti tutti i componenti necessari alla sintesi proteica ma privi di RNA messaggero, in cui venne successivamente aggiunto un mRNA sintetico, costituito da ripetizioni continue della stessa base azotata, l’acido poliuridilico o poli-U. Di volta in volta uno dei venti amminoacidi necessari veniva sostituito con lo stesso amminoacido marcato radioattivamente; dopo la centrifugazione fu quindi possibile scoprire il polipeptide marcato, che era composto interamente dall’amminoacido fenilalanina e quindi, indirettamente, la tripletta (codone) corrispondente, cioè UUU. Con un metodo analogo furono decifrati tutti i codoni possibili per i 20 amminoacidi. Come si può notare dalla tabella sottostante che li riporta, esistono in genere diversi codoni per lo stesso amminoacido: il codice genetico è quindi ridondante. Inoltre per quasi tutti gli organismi è sempre lo stesso: si dice che il codice genetico è universale.

Il codice genetico

Come si legge la tabella del codice genetico? Facciamo un esempio: mettiamo di dover scoprire qual è l’amminoacido corrispondente al codone AGC. La prima lettera è la A: quindi seguiremo il terzo blocco dall’alto (quello con la lettera A più grande, subito a sinistra). Poi ci posizioniamo sulla colonna della G e, seguendo sempre il blocco con la A grande, cerchiamo la lettera G sull’ultima colonna. Si può vedere facilmente che l’amminoacido corrispondente è la serina (ser).

mRNA o RNA messaggero

Questa molecola rappresenta il trascritto del DNA. È costituita da un filamento singolo, polimerizzato in direzione 5’ → 3’, utilizzando come stampo il filamento 3’ → 5’ del DNA, filamento detto antisenso. L’enzima che catalizza la polimerizzazione è l’RNA polimerasi che riconosce sullo stampo una particolare sequenza nucleotidica detta promotore. La catena di DNA viene aperta dall’enzima stesso e la sintesi dell’mRNA procede fino a che l’RNA polimerasi non incontra una seconda sequenza nucleotidica, detta sequenza di terminazione, giunta alla quale la trascrizione termina. Nei procarioti questo trascritto è pronto per la successiva traduzione; negli eucarioti deve subire la maturazione, detta anche splicing. Infatti nel secondo caso il trascritto primario, che viene detto pre-mRNA, possiede dei tratti detti introni, i quali non vanno tradotti. Gli unici tratti che verranno espressi sono gli esoni. Il pre-mRNA subisce quindi una rielaborazione: sulla estremità 5’ viene legata una molecola di 7-metilguanosina detta CAP (cappuccio) mentre all’estremità 3’ viene aggiunto un segmento di numerosi residui di adenosina detta coda poli-A. Il CAP è necessario per rendere stabile l’mRNA. Prima di essere diretto al citoplasma, però, gli introni vengono rimossi ed eliminati mentre gli esoni vengono legati assieme, per formare l’mRNA maturo. Quest’ultimo viene avviato al citoplasma per essere tradotto.

Traduzione dell’mRNA: la sintesi proteica

La traduzione è il processo di sintesi proteica, effettuata dai ribosomi, utilizzando le informazioni fornite dall’RNA messaggero che è, a sua volta, la copia di un gene”.

Il processo di sintesi delle proteine è chiamato traduzione, in quanto le cellule “leggono” un messaggio costruito con una sequenza di basi azotate e lo “traducono” in una sequenza di amminoacidi. Nel processo di traduzione sono coinvolti tre tipi di RNA, ciascuno con una funzione specifica ma complementare a ciascun altra; solo insieme, infatti, essi possono portare a compimento il processo.

Tre tipi di RNA
  • L’RNA ribosomiale (rRNA) è una parte essenziale delle due subunità che formano i ribosomi.
  • L’RNA messaggero (mRNA) è incaricato di trasferire le informazioni genetiche dal nucleo ai ribosomi, in modo che possano essere espresse come proteine.
  • L’RNA transfer (tRNA) svolge un ruolo fondamentale nel trasporto degli amminoacidi ai ribosomi, nell’ordine corretto.
Ribosomi

I ribosomi sono organuli presenti nel citoplasma; negli eucarioti spesso sono associati al reticolo endoplasmatico. Sono nucleoproteine, cioè sono strutture complesse costituite da una combinazione di proteine e di RNA che viene chiamato RNA ribosomiale, abbreviato in rRNA. Questo RNA, come tutti gli RNA, è il prodotto della trascrizione di una determinata regione del DNA. Queste strutture complesse, che si muovono fisicamente lungo una molecola di RNA detto messaggero, catalizzano la formazione del legame peptidico tra gli amminoacidi, formando così la catena polipeptidica. Esse legano anche un altro tipo di RNA, detto di trasporto e varie altre proteine accessorie necessarie alla sintesi proteica. I ribosomi sono formati da due parti separate, dette subunità (maggiore e minore), ciascuna delle quali contiene il proprio rRNA. Nei procarioti i ribosomi hanno un tasso di sedimentazione di 70 S (svedberg): la subunità maggiore è di 50 S mentre quella minore è di 30 S. Negli eucarioti i ribosomi hanno un tasso di sedimentazione di 80 S: la subunità maggiore è di 60 S mentre quella minore è di 40 S.

Il tRNA

È l’RNA di trasporto (transfer), così chiamato perché porta legati a sé gli amminoacidi necessari alla sintesi. Le cellule contengono più di 20 diverse molecole di tRNA, almeno una per ciascuno dei diversi amminoacidi. È una molecola formata da più di 80 nucleotidi legati in maniera da formare una caratteristica configurazione a trifoglio. La catena termina sempre con una sequenza CCA presso la sua estremità 3’. A questa estremità si legherà uno specifico amminoacido (reazione catalizzata dall’enzima amminoacil-tRNA-sintetasi con idrolisi di una molecola di ATP). Alcune parti (verde scuro) sono uguali in tutti i tRNA, mentre le altre possono variare. Nell’ansa centrale è presente una sequenza di 3 basi azotate detta anticodone, complementare ad uno specifico codone dell’mRNA.

Meccanismo della traduzione
  • Ora che abbiamo visto quali sono i “protagonisti” della traduzione, vediamo come essa si svolge.
  • Fondamentalmente possiamo suddividerla in tre fasi:
    1. Inizio
    2. Allungamento
    3. Terminazione

Inizio

La subunità minore del ribosoma si lega all’estremità 5’ dell’mRNA in corrispondenza di un codone particolare (in genere 5’-AUG-3’) che è complementare all’anticodone (in genere 3’-UAC-5).

  • Poi il primo tRNA si colloca in modo da appaiarsi al sito di inizio dell’mRNA.
  • Nei procarioti il tRNA che possiede questo anticodone trasporta la formilmetionina (fMet), che, terminata la sintesi, verrà rimossa.
  • Si forma così il complesso di inizio (subunità minore – mRNA – primo tRNA)
  • Una volta che si è formato il complesso di inizio, la subunità maggiore è in grado di legarsi alla subunità minore.
  • Il tRNA viene alloggiato in un particolare sito del ribosoma detto P (peptide).

Allungamento

  • Il secondo codone dell’mRNA si trova in corrispondenza del sito A (amminoacile) della subunità maggiore; qui alloggerà un secondo tRNA.
  • Si forma il legame peptidico tra i due amminoacidi.
  • L’mRNA scorre in avanti di un codone, per cui il primo tRNA si viene a trovare in corrispondenza di un terzo sito, il sito E (exit), da cui uscirà
  • Il secondo tRNA porta con sé la catena in allungamento e passa dal sito A al sito P
  • Il sito A è libero e
  • può accogliere un terzo tRNA
  • Questa fase si ripete più volte

Ricapitolando: Il sito E riceve il tRNA che deve allontanarsi. Il sito P accetta il tRNA recante la catena polipeptidica in formazione. Il sito A accoglie il tRNA con il nuovo amminoacido che si dovrà aggiungere alla catena

Terminazione

  • La sintesi termina in corrispondenza di uno di questi 3 codoni: UAA, UAG e UGA, detti codoni di stop.
  • Dato che non esistono anticodoni per queste triplette, nel sito A si inserisce una particolare molecola detta fattore di rilascio (RF, da release factor).
  • La traduzione cessa, le subunità si separano e l’mRNA può essere riutilizzato per una successiva sintesi proteica.

Polisoma

Durante il processo di allungamento, la parte iniziale dell’mRNA può essere disponibile all’attacco di un altro ribosoma, che forma un nuovo complesso di inizio. Può così formarsi un gruppo di ribosomi, detto poliribosoma o polisoma. Ciò serve quando la cellula deve produrre grandi quantità di proteine.

Ingegneria Genetica: il Sistema Crispr/Cas

Il sistema CRISPR/Cas consente di modificare in modo rapido ed economico una precisa regione del DNA e ha catturato l’attenzione di tutta la comunità biotecnologica per la sua versatilità e le sue innumerevoli applicazioni. L’avvento di CRISPR/Cas apre però molti nuovi interrogativi di natura bioetica. Questo articolo vuole fornire un’introduzione generale al sistema e fare chiarezza sul suo utilizzo, sulle potenziali applicazioni in diversi campi e sulle relative controversie etiche.

Da meccanismo immunitario naturale a potente strumento biotecnologico
Per comprendere il funzionamento dei geni del nostro corpo e di qualsiasi organismo è importante studiare cosa accade quando se ne modifica l’espressione. Per secoli gli scienziati si sono dovuti accontentare di osservare gli effetti di mutazioni spontanee o di usare sostanze che introducevano errori casuali nel genoma di piante, animali o cellule in coltura. Negli ultimi anni sono state messe a punto nuove tecniche, dette di “genome editing”, che permettono di apportare modifiche precise ai geni che si vogliono studiare, velocizzando enormemente i progressi nella ricerca biologica. In futuro, queste tecniche potrebbero anche essere impiegate per “correggere” alterazioni responsabili di malattie geniche o modificare alcuni caratteri vegetali. Tra esse, il sistema più recente e promettente è noto come CRISPR/Cas. Dietro questo strano nome si cela originariamente un meccanismo immunitario che alcuni organismi unicellulari (come i batteri) utilizzano per difendersi dai virus. Questi organismi contengono dei frammenti di RNA “guida” noti come CRISPR, che funzionano come delle sentinelle molecolari riconoscendo, per appaiamento di basi, le sequenze di DNA estraneo. Una volta riconosciuto e agganciato il DNA estraneo, le CRISPR guidano su di esso un enzima detto Cas (CRISPR-associated), una endonucleasi che, funzionando come un paio di forbici, taglia il DNA intruso, impedendone la replicazione. Le sequenze CRISPR furono scoperte già nel 1987 da Ishino e colleghi , ma il loro ruolo venne completamente compreso solo trent’anni dopo, nel 2007

Da allora e in particolare da quando, nel 2012, il sistema è stato reso personalizzabile dai gruppi di ricerca di Jennifer Doudna e Emmanuelle Charpentier , i biotecnologi stanno provando a sfruttare questo sistema di difesa naturale per introdurre modifiche specifiche nel genoma di organismi molto più complessi dei batteri, come animali e piante . Per fare questo, si utilizza il sistema CRISPR accoppiato ai sistemi di riparazione del DNA presenti nella cellula, che, dopo il taglio da parte di Cas, operano una ricucitura secondo diversi meccanismi. Alcuni di questi meccanismi sono per natura imprecisi e introducono “errori” nella sequenza, cosicché a volte il gene modificato diventa non più funzionale. Questa modalità può essere sfruttata per eliminare l’espressione di un gene di cui si vuole studiare la funzione. Un altro meccanismo di riparazione, chiamato “ricombinazione omologa”, agisce con precisione, permettendo di riparare il taglio e di inserire sequenze desiderate. Grazie a questa strategia, è possibile non solo studiare l’effetto dell’introduzione di determinate mutazioni ma anche, ad esempio, correggere le mutazioni che causano malattie genetiche.

Figura 1 – Rappresentazione schematica di come si può sfruttare il sistema CRISPR-Cas per modificare il genoma di un organismo. Nel caso più semplice (in alto) dopo il taglio effettuato dall’enzima Cas il DNA è riparato mediante meccanismi cellulari imprecisi che possono portare a delezioni, inserzioni e/o sostituzione di nucleotidi con conseguente perdita di funzionalità del gene (“knock-out”). Nel secondo caso (in basso), insieme all’enzima Cas e alla sequenza CRISPR si introduce nella cellula anche una molecola di DNA contenente la sequenza desiderata. Questa molecola servirà da “stampo” per modificare il DNA delle cellule in modo preciso (mediante il processo della ricombinazione omologa).

Il sistema è già stato utilizzato con successo per risolvere controversie scientifiche di lunga data e comprendere il ruolo di molti geni a funzione sconosciuta . Si tratta di una vera e propria rivoluzione in ambito biotecnologico, che ha suscitato un interesse crescente, come dimostrato anche dalla rapida impennata nelle pubblicazioni : se il primo articolo scientifico che propone l’uso delle CRISPR per l’ingegneria genetica è stato pubblicato nel 2012, oggi il portale scientifico Pubmed conta già migliaia di referenze bibliografiche sull’argomento, tra articoli scientifici originali e review. Il sistema CRISPR/Cas sta anche a poco a poco soppiantando metodi più obsoleti per studiare le cause genetiche e il decorso di malattie, come vari tipi di cancro (su modelli cellulari e animali), nonché l’efficacia di farmaci . Le maggiori probabilità di successo sono attese per la cura di malattie del sistema immunitario. Le cellule immunitarie, infatti, si possono isolare, modificare in vitro e reintrodurre nel paziente una volta “corrette”. Questa strategia ha già permesso di generare in vitro linfociti T resistenti all’HIV .

In ambito vegetale, il sistema CRISPR/Cas mostra sorprendenti potenzialità. Non solo si rivela uno strumento importante per la ricerca di base, ma permette anche di generare piante con migliori caratteristiche nutrizionali o resistenti a patogeni, come nel caso di una recente varietà di pomodoro resistente all’oidio in corso di perfezionamento nei laboratori del Sainsbury Laboratory a Norwich (Gran Bretagna) . Sebbene tutto ciò sia già in parte possibile con incroci tradizionali, il sistema CRISPR/Cas è molto più specifico e permette di ottenere i risultati in pochi mesi anziché anni. Inoltre, rispetto alle tecniche di biologia molecolare utilizzate finora, non necessita dell’introduzione di porzioni di DNA proveniente da altre specie, come geni per resistenze ad antibiotici o erbicidi. La stessa proteina Cas viene introdotta solo per il tempo necessario a correggere il genoma della pianta, ma può essere successivamente eliminata senza lasciare traccia, grazie degli incroci mirati con la pianta selvatica .

Figura 2 – Rappresentazione semplificata delle modifiche al DNA introdotte in una pianta OGM generata con tecniche tradizionali o mediante applicazione della tecnica CRISPR-Cas.

CRISPR/Cas su embrioni umani: un difficile conflitto etico
Nonostante tutti questi promettenti risultati, a far conoscere il sistema CRISPR/Cas al grande pubblico è stato uno studio molto controverso apparso nell’aprile 2015 sulla rivista Protein&Cell. I ricercatori, un’équipe cinese diretta dal Prof. Junjiu Huang, hanno provato a utilizzare la tecnica per correggere la mutazione genica della beta talassemia (nota anche come anemia mediterranea) in embrioni umani non vitali, ovvero destinati alla ricerca e non in grado di svilupparsi . Le conclusioni dello studio erano positive, in quanto alcuni degli embrioni sottoposti a taglio CRISPR/Cas e ricombinazione omologa avevano sostituito il gene corretto a quello mutato ed erano quindi “guariti”. I numeri, però, erano impietosi: solo 28 embrioni su 54 avevano subito il taglio di Cas e solo in quattro embrioni alcune cellule avevano effettuato la ricombinazione omologa riparatrice.

Si era anche osservato un alto numero di mutazioni indesiderate potenzialmente pericolose. Questi problemi sono dovuti al fatto che l’enzima Cas a volte non è in grado di distinguere tra la sequenza-bersaglio, che non può eccedere le 20 paia di basi, e un frammento di DNA molto simile. Più il genoma è lungo, più è alta la probabilità di trovarvi più copie della sequenza bersaglio o sequenze simili (il genoma degli organismi unicellulari che usano CRISPR/Cas a scopi difensivi è in media 1000 volte più piccolo di quello di piante e animali). Nel riportare i risultati dello studio, la stampa italiana e internazionale ha spesso usato toni allarmanti dovuti alla bassa efficacia della tecnica e all’alto rischio di errore. Di certo è ancora presto per pensare a delle applicazioni terapeutiche a livello embrionale ma i numeri dello studio di Huang e colleghi non scoraggiano gli esperti, i quali sono comunque pienamente coscienti dei difetti attuali del sistema CRISPR/Cas e hanno già proposto molte promettenti strategie di miglioramento. Contemporaneamente, una sempre più ampia conoscenza dei genomi permette di scegliere con maggiore accortezza la sequenza bersaglio.

Sul piano bioetico, però, anche alcuni scienziati hanno reagito con preoccupazione all’articolo di Huang e colleghi. In questo caso, gli embrioni umani usati non avrebbero potuto svilupparsi e dare origine a una nuova vita, ma in futuro altri scienziati potrebbero voler tentare di applicare la tecnica anche su embrioni normali. Lo studio riporta quindi alla luce il grosso dilemma dell’eugenetica, ovvero se sia lecito effettuare modifiche genetiche sull’uomo (anche se solo a scopo terapeutico o di ricerca di base) e se studi di tale genere debbano essere incoraggiati e resi pubblici. Secondo quanto dichiarato dagli stessi autori del discusso articolo, le prestigiose riviste Nature e Science avrebbero rifiutato la pubblicazione della ricerca proprio per ragioni etiche.

OGM oppure no?
In ambito agronomico, il metodo CRISPR/Cas scatena meno problemi etici ma sta complicando l’aspro dibattito sugli OGM. Le mutazioni introdotte da questa tecnica possono infatti essere così piccole e localizzate da diventare indistinguibili da quelle “naturali”, dovute cioè a fattori di stress come un eccessivo irraggiamento solare. Queste mutazioni sarebbero sufficienti per classificare tali piante come OGM? Per ora, gli Stati Uniti sembrano propendere per il no, mentre in Europa si va in direzione del sì, in quanto per l’Unione Europea un OGM è definito tale non in base alle caratteristiche finali del prodotto ma in base alla tecnologia scelta per generarlo. Nella Direttiva 2001/18/CE del Parlamento europeo e del Consiglio del 12 marzo 2001 si legge infatti che OGM è ogni organismo “il cui materiale genetico è stato modificato in modo diverso da quanto avviene in natura con l’accoppiamento e/o la ricombinazione genetica naturale”. Le norme vigenti sono però state adottate in un’epoca in cui il sistema CRISPR/Cas era ancora sconosciuto e quindi non era stato preso in considerazione. Se, come previsto, i centri di ricerca pubblici e privati genereranno, a breve, piante di interesse commerciale con questo sistema sarà necessario colmare il vuoto legislativo sia in Europa sia nel resto del mondo, in modo da disciplinare la produzione e l’immissione sul mercato di questi prodotti. Alcune compagnie stanno già cercando di approfittare il più possibile dell’attuale inadeguatezza nelle regolamentazioni per acquisire notorietà e guadagnare mercato. È il caso di Cibus, un’industria biotecnologica statunitense con filiale in Olanda che utilizza un sistema di modifica genetica mirato detto “Rapid Trait Development System”, di fatto molto simile a CRISPR/Cas. L’azienda ha già immesso sul mercato americano una varietà di manioca resistente a un erbicida e sul suo sito internet sponsorizza i propri prodotti sottolineandone l’accettabilità anche in Paesi contrari agli OGM, in quanto “non transgenici”.

Interrogativi ecologici
L’utilizzo più controverso di CRISPR/Cas è forse quello in cui il sistema è “autoreplicante” . In questo caso, una copia del gene Cas e della sua sequenza guida si inseriscono all’interno del genoma della cellula bersaglio. Ad ogni generazione successiva, il meccanismo può quindi riattivarsi e riprodurre la mutazione nel 100% della progenie. I vantaggi sarebbero enormi, non solo nella biotecnologia vegetale ma anche, e forse soprattutto, per il controllo degli insetti. Ciò consentirebbe, ad esempio, di mutare le zanzare in modo da renderle immuni al plasmodio portatore della malaria (come è già stato fatto con successo in laboratorio ), e debellare così la malattia, oppure rendere completamente innocui insetti pericolosi per le coltivazioni. Allo stesso modo si potrebbe agire su altri vettori di malattie come il virus Zika. La scarsa prevedibilità delle conseguenze ecologiche suggerisce però di procedere in questo settore con molta cautela.

Una sfida non solo scientifica
A meno di cinque anni dal primo studio biotecnologico che ne fece uso, CRISPR/Cas sta rivoluzionando l’ingegneria genetica e nel prossimo futuro promette di essere la base per importanti innovazioni in ambito terapeutico, alimentare ed ecologico. Al contempo, sta però anche smantellando la frontiera tra terapie e eugenetica e quella tra OGM e alimenti tradizionali, aprendo così nuovi interrogativi, anche di tipo ecologico.I ricercatori, in particolare coloro che sono stati protagonisti della scoperta di CRISP/Cas, sono coscienti delle difficoltà e stanno cercando di creare i giusti spazi per discutere in maniera chiara e aperta delle nuove sfide di CRISPR/Cas (l’ultimo congresso sull’argomento si è tenuto a Washington D.C. lo scorso dicembre). Gli sviluppi di questa nuova tecnologia non dipenderanno, quindi, soltanto dai risultati sperimentali ma anche dall’esito di un urgente dialogo tra scienza e società, a cui siamo tutti invitati.

 

Referenze

  1. Chimica Organica, H. Hart, C.M. Hadad, L.E. Craine, D.J. Hart
  2. Rocco Lombardo – Lezioni di biologia molecolare
  3. Dahm R, Friedrich Miescher and the discovery of DNA, in Dev Biol, vol. 278, nº 2, 2005, pp. 274–88, PMID 15680349
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